eLife | 德国马普发育所揭示​宿主相关微生物PCR能够方便地测量微生物总量和群落组成！

了解单个分类群的相对丰度可以揭示任何生态群落的重要信息，包括微生物群落。了解它们在样品中组成的权宜之计是对规定数量的16S或18SrRNA基因（以下简称rDNA）、rRNA的内部转录间隔（ITS）或其他区分样品中微生物种类的扩增子进行测序和计数（Molecular Ecology Resources | 耶拿大学改良扩增子测序提升微生物组多样性研究！）。然而，这些常见的扩增子计数-测序方法并不能提供关于微生物密度的信息。最关键的是，这种微生物序列计数缺乏一个分母，说明采样的生境数量，因此，尽管大多数研究系统是开放系统，其中微生物细胞的总数可以在许多数量级上变化，但稀疏的定殖地和密集的定殖地的样品变得不可区分。这种组成数据的另一个限制是，由于所有微生物的总和受到限制，一种微生物丰度的增加会降低所有其他微生物的相对丰度，在没有适当的统计方法的情况下，会产生误导性的解释。微生物负荷的实验测定，例如通过将微生物丰度与样品的体积、质量或表面积联系起来，导致了微生物组研究中的重要见解，否则相对丰度数据将被忽略。

对于许多与宿主相关的微生物组样品，特别是那些来自植物、线虫、昆虫和其他生物的样品，在这些样品中很难或不可能从宿主组织中物理分离出微生物，彻底的DNA提取会同时产生宿主和微生物的DNA。对于这样的样品，来自宿主和微生物的DNA数量与采样的细胞数量成正比，因此，微生物DNA与宿主DNA的比率是衡量样品中微生物负荷的内在标准。研究人员试图利用这一特性，使用作为微生物rDNA副产物的宿主rDNA扩增来计算微生物负荷，但由于宿主核糖体可能有数百或数千个拷贝，而且组织DNA也过于丰富，这些方法效率低下，需要进行干预以增加微生物信号。深度宏基因组测序（WMS）原则上也可以描述微生物群落的组成并测量微生物负荷，但由于类似的宿主DNA的过多，很少实用。例如，野生拟南芥的叶子提取物的WMS通常产生>95%的植物DNA和<5%的微生物DNA。此外，许多WMS序列仍然无法分类，因此在复杂的样品中无法量化。

2021年8月26日，国际权威学术期刊eLife发表了德国马普发育生物学研究所Detlef Weigel教授（近5年165篇高水平文章！Detlef Weigel院士团队在植物微生物共进化领域取得重大进展！）团队的最新相关研究成果，题为Host-associated microbe PCR (hamPCR) enables convenient measurement of both microbial load and community composition的研究论文。

微生物种群规模相对于宿主组织量的比率，或 "微生物负荷"，是定殖和感染的基本指标，但它不能直接从微生物扩增子数据（如16S rRNA基因计数）中推断出来。由于现有的确定负荷的方法，如连续稀释、定量PCR和深度宏基因组测序，增加了大量的成本和/或实验负担，它们只是很少与扩增子测序相配。本研究介绍了宿主相关的微生物PCR（hamPCR），这是一个强大的策略，既可以量化微生物负荷，又可以描述单一扩增子库中的微生物群落组成。科研人员在多个研究系统中证明了它的准确性，包括线虫和主要农作物，并进一步提出了一种节省成本的技术，以减少测序前库中过多的宿主序列。hamPCR为众所周知的局限性和统计学上的挑战提供了一个可获得的实验解决方案，它在独立于培养物的微生物学中具有深远的潜力。

图1. 合成样品展示了技术可重复性

图2. hamPCR很稳定，不会扭曲复杂的微生物群落

图3. 在为高效测序而重新混合hamPCR扩增子后，可以重建原始丰度

图4. hamPCR与三种常见的16SrDNA扩增子的结果一致，与整个宏基因组测序（WMS）一致

图5. hamPCR可以推广到两个以上的扩增子、非植物宿主和大型或多倍体宿主基因组上

图6. hamPCR可以为作物植物中微生物的相互作用提供新的见解

更多精彩内容，点击下方“往期回顾”

点个在看你最好看